椴木培养牛樟芝子实体酒精萃取物对大白鼠中大脑动脉阻塞缺血性中风之神经保护作用
许亚婷国立台湾海洋大学
年6月
在美国，每年有,件中风新案例出现，并且排名位居前十大死因第三名。缺血型中风占中风发生率70%，而缺血型中风主要是因为血液供应减少，无法运输氧气和养分，进而造成神经功能缺损。牛樟芝为台湾最著名之传统偏方，但目前很少人将牛樟芝探讨其神经保护机制，因此本研究目的在于评估牛樟芝酒精萃取物在体外试验部分是否可防止H2O2及CoCl2诱导下之氧化压力伤害，并防止体内试验在缺血再灌注下诱导之脑损伤。结果显示，牛樟芝酒精萃取物具有清除自由基之能力，并可抑制PC12类神经细胞及C6胶质瘤细胞受到H2O2及CoCl2诱导下之脂质过氧化及活性物质ROS之生成，进而增加细胞存活率。
以牛樟芝酒精萃取物(、、mg/kg)管喂SD大鼠三周后可改善中大脑动脉梗塞手术(MCAO)所引起之Nrf2及HO-1mRNA表现，下调发炎因子TNF-α、iNOS和COX-2，增加缺氧诱导因子HIF-1α表现，并恢复缺血再灌注下之抗氧化酵素GPx、CAT及SOD活性。此外，在缺血再灌注后其脂质过氧化表现随着牛樟芝酒精萃取物剂量的提升呈现剂量依赖性地减少。因此本研究猜测牛樟芝酒精萃取物可预防缺血性中风是藉由抗氧化及抗发炎机制达到有效的神经保护作用。
结果与讨论
(一)牛樟芝酒精萃取物其抗氧化能力分析
1.DPPH自由基清除能力
DPPH为一稳定的自由基，其用来侦测抗氧化物质的供氢能力，当DPPH被抗氧化剂还原，或与一自由基结合时，其吸光值会降低，以此特性测试AC-AE之抗氧化能力。在此以已被证实具有良好抗氧化质量之Trolox、NAC及resveratrol为标准品来对照并验证样品清除自由基能力，结果显示AC-AE在剂量为μg/ml时其清除率为90%、resveratrol为87%、NAC为74%而AC-AE清除率较低为68%，但与ROS抑制剂NAC相比其清除率相差不远，如能提高AC-AE剂量则清除能力也会随之升高(图一)。Resveratrol已证实其生理活性在人体中具有治疗效果，如抗氧化、抗发炎、抗衰老、抗糖尿病、控制细胞凋亡周期等，而目前应用在心血管疾病和神经退化疾病上(BaurandSinclair,;HarikumarandAggarwal,)。
图一、椴木牛樟芝子实体酒精萃取物对DPPH自由基清除能力。
2.还原能力
还原力以测定普鲁士蓝生成量为指标，当赤血盐(K3Fe(CN)6)还原成黄血盐(K4Fe(CN)6)后，会与Fe3+形成复合物普鲁士蓝，并于ODnm下具有最大吸光值，因此可藉此检验AC-AE还原力能力(Jacobetal.,)；并以trolox作为对照组比较之。结果显示在μg/mL下trolox吸光值为0.65(ODnm)，AC-AE则为0.(ODnm)，表示AC-AE还原力虽较trolox差，但仍具有还原之能力(图二)。
图二、椴木牛樟芝子实体酒精萃取物之还原能力。
(二)牛樟芝酒精萃取物在氧化及低氧损伤下对神经细胞保护作用
1.牛樟芝酒精萃取物对于细胞存活率之影响
首先先单纯测定AC-AE对于C6及PC12细胞是否会有毒性伤害，而从结果得知C6细胞以5mg/mL为最高浓度之下其细胞存活率皆高于50%以上，且浓度在0.mg/mL时存活率为95%以上，因此接下来实验皆以0.mg/mL为最高剂量，而在PC12细胞则以6mg/mL为最高浓度之下其细胞存活率于2mg/ml时达于IC50(半致死剂量)，而浓度在0.mg/mL时存活率为%，因此接下来实验皆以0.01mg/mL为最高剂量(图三)。而AC-AE为非水溶性物质，因此本研究以DMSO进行回溶，而在先前试验已得知以MTT单纯测定10%之DMSO对于PC12及C6细胞之伤害表现，在PC12细胞部分IC50约为7.57%，在C6细胞部分IC50约为4.73%，而本研究样品之最高Stock为12mg/mL，其内含1.65%DMSO，并从此结果换算得之存活率皆高于80%，表示此剂量对此两株细胞并不会造成伤害。
图三、椴木牛樟芝子实体酒精萃取物对C6及PC12之细胞存活率影响。
2.牛樟芝酒精萃取物对H2O2及CoCl2诱导氧化及低氧损伤下其细胞存活率之影响
已有文献指出神经退化疾病中活性物质有增加的现象并且会造成氧化压力，而过多的活性物质会导致脂质，蛋白质及DNA的氧化，并造成细胞中的细胞成分损伤(NakamuraandLipton,；Simaoetal.,)；而过氧化氢，为一个典型的氧化压力，来源主要为超氧阴离子和羟自由基，目前已被广泛作为细胞损伤模型(Jiangetal.,)。因此本研究先以MTT测定AC-AE与H2O2及CoCl2共培养18hr测其对C6及PC12细胞存活率之影响。一开始先单纯测定C6与H2O2及CoCl2共培养18hr之细胞存活率，而从结果显示C6细胞在2mMH2O2模拟氧化压力下其IC50约为μM，而以1.2mMCoCl2诱导缺氧环境下之IC50约为μM，因此将以以上浓度做为C6之模拟氧化压力及缺氧环境下之损伤环境(图四)；另一方面PC12与H2O2及CoCl2共培养18hr后在1mMH2O2模拟氧化压力之下其IC50约为μM，而以1.2mMCoCl2诱导缺氧环境下之IC50约为μM，因此将以以上条件做为PC12诱导细胞损伤浓度(图五)；之后将C6以0.mg/mLAC-AE及1mMNAC预处理四小时后再以μMH2O2及μMCoCl2进行作用，从结果显示C6细胞在先以78μg/mLAC-AE做为预处理的组别与单纯以H2O2与CoCl2诱导伤害组相较下，随着AC-AE剂量的提升，其细胞存活率有上升趋势(图六)；而在PC12细胞部分以10μg/mLAC-AE及1mMNAC预处理四小时后再以μMH2O2及μMCoCl2进行作用，从结果显示PC12细胞在H2O2诱导伤害下随着AC-AE的提升，并无显著差异，但与伤害组比较下，其存活率大部分皆有上升趋势，而在CoCl2诱导的组别则以5μg/mL存活率效果较佳(图七)。因此证实先以AC-AE预处理后可降低H2O2及CoCl2对神经细胞之伤害。已有研究显示，CoCl2会诱导HIF-1α的生成，增加ROS生成使caspase-3活化进而使神经细胞凋亡，而以NAC预处理后可降低此情况发生(Lanetal.,)；另一方面，单纯加入H2O2之组别随着剂量的提升，细胞存活率有下降趋势，但同时加入NAC与0.5mM之H2O2共培养下，其细胞存活率有显著的回升(Ohetal.,)。
图四、H2O2及CoCl2对C6之细胞存活率影响。
图五、H2O2及CoCl2对PC12之细胞存活率影响。
图六、椴木牛樟芝子实体酒精萃取物在H2O2诱发氧化压力以及CoCl2模拟缺
氧缺血环境下对C6细胞存活率之影响。
图七、椴木牛樟芝子实体酒精萃取物在H2O2诱发氧化压力以及CoCl2模拟缺氧缺血环境下对PC12细胞存活率之影响。
3.牛樟芝酒精萃取物对H2O2诱导氧化压力下ROS生成之影响
在缺血再灌注此期间，活性氧会逐渐上升，如超氧阴离子、羟自由基过氧化氢和一氧化氮产生的代谢物，这些活性物质会参与氧化反应使细胞大分子损伤，如核酸，蛋白质等，进而导致脂质，DNA的氧化，造成细胞的损害(ChanPH.)。本实验以非极性DCFH-DA渗入细胞再经胞内esterase水解成DCFH，当细胞中含有ROS则会进行去酯化从无荧光的DCFH变成有荧光性的DCF，DCF越高表示DCFH-DA氧化程度越高，细胞氧化程度也越高(Simaoetal.,)。因此在此以流式细胞仪侦测以H2O2模拟细胞在氧化压力下AC-AE是否可降低细胞内ROS生成量；结果显示在C6细胞实验部分H2O2伤害之组别ROS表现量比起控制组有显著上升趋势，但在以AC-AE做为预处理下，其ROS表现量有下降趋势，并且AC-AE组别之ROS生成量皆比正控制组NAC还要低(图八)；而在PC12细胞实验部分可看出单纯以H2O2伤害之组别ROS表现量显著高于其他组，但在以AC-AE做为预处理下，其ROS表现量有下降表现，且以2.5μg/ml及10μg/ml之ROS生成量最低(图九)。因此证实AC-AE可改善H2O2模拟氧化压力所造成的细胞损伤。
图八、不同浓度椴木牛樟芝子实体酒精萃取物以H2O2诱发诱发氧化压力下对C6细胞内ROS生成量之影响。
图九、不同浓度椴木牛樟芝子实体酒精萃取物以H2O2诱发氧化压力下对PC12细胞内ROS生成量之影响。
4.牛樟芝酒精萃取物对CoCl2诱导低氧损伤下ROS生成之影响
神经组织在缺氧时会大量生成ROS并导致组织中细胞凋亡，而CoCl2可使PHD无法携带氧与二价铁离子进而使HIF-1α稳定且不被proteasome分解，因此本实验以CoCl2来模拟缺氧环境并探讨AC-AE对于细胞在缺氧下之存活表现。结果显示C6细胞先以AC-AE做为预处理后再以CoCl2进行诱导伤害，其有给予AC-AE的组别，ROS生成量比起单纯以CoCl2伤害之组别还要来的低，且呈现剂量相关性(图十)；另外在PC12细胞实验部分，有给予AC-AE之组别ROS含量于5μg/mL及10μg/mL组有显著下降趋势(图十一)。因此证实AC-AE可改善CoCl2模拟缺氧环境所造成的细胞损伤。
图十、不同浓度椴木牛樟芝子实体酒精萃取物以CoCl2模拟缺氧缺血下对C6细胞诱发胞内ROS生成量之影响。
图十一、不同浓度椴木牛樟芝子实体酒精萃取物以CoCl2模拟缺氧缺血下对PC12细胞诱发胞内ROS生成量之影响。
5.牛樟芝酒精萃取物对H2O2和CoCl2诱导氧化及低氧损伤下造成脂质过氧化之影响
脂质过氧化作用为细胞损伤的机制之一，并常用于细胞或组织损伤之指针。当体内脂质氧化太多时，会裂解成丙二醛(MDA)，而丙二醛会和体内脂质，蛋白质，核酸等形成交错反应，从而使细胞膜的流动性和通透性发生变化，导致细胞结构和功能的改变(HalliwellandGutteridge,)。从结果可看出在C6细胞实验部分，先以AC-AE做为预防之组别与H2O2组相比，其MDA含量随着剂量的提升呈现剂量依赖性下降趋势，并以0.mg/mL之组别MDA下降程度与正控制组NAC相差不大；而在CoCl2诱导缺氧部分则也有显著效果，AC-AE组别与CoCl2组相比，其MDA含量随着剂量的提升呈现剂量依赖下降趋势，尤其以0.mg/mL之组别下降效果最甚(图十二)。另一方面，在PC12细胞实验部分，先以AC-AE做为预防之组别与H2O2组相比，其MDA含量随着剂量的提升呈现剂量依赖性下降趋势，并于5μg/mL及10μg/mL之组别MDA含量下降至与控制组相同；而在CoCl2诱导缺氧部分则也有显著效果，AC-AE组别与CoCl2组相比，其MDA含量随着剂量的提升呈现剂量依赖性下降趋势，并在5μg/mL时下降程度就与控制组相似(图十三)。研究指出在1mMH2O2诱导下其MDA含量比起正常组别上升了52%，但先以resveratrol做为预防下再以1mMH2O2诱导其MDA含量有显著降低的趋势(Quincozes-Santosetal.,)。
图十二、椴木牛樟芝子实体酒精萃取物对在H2O2诱发氧化压力以及CoCl2模拟缺氧缺血环境下对C6细胞脂质过氧化作用影响。
图十三、椴木牛樟芝子实体酒精萃取物对在H2O2诱发氧化压力以及CoCl2模拟缺氧缺血环境下对C6细胞脂质过氧化作用影响。
(三)牛樟芝酒精萃取物对缺血性中风大鼠之影响
1.牛樟芝酒精萃取物对中风体积之影响
为了确定以AC-AE作为预防下，其中风大鼠是否可降低梗塞区域，因此将大鼠脑部取出后每片以2mm厚度进行切片并以TTC染色观察其中风面积，结果显示喂食AC-AE三周后之组别与伤害组相比其随着剂量的提升中风梗塞面积有显著性缩小趋势，并以4X组最佳，并且也较正控制组resveratrol效果来的好(图十四)。已有文献指出在中风后加入resveratrol5mg/kg3小时后与伤害组相比可降低中风梗塞面积36%(Shinetal.,)；而AC-AE在此可有效降低中风体积甚至更甚于resveratrol，因此AC-AE可显著改善中风后所造成之梗塞情形。
图十四、椴木牛樟芝子实体酒精萃取物对中风大鼠脑中风体积之影响
2.牛樟芝酒精萃取物对促发炎因子(TNF-α)表现之影响
另外将测定脑中促发炎因子TNF-α活性表现进而观察AC-AE是否可减低发炎现象。由结果显示vehicle组不论在血清亦或是脑组织中TNF-α活性表现有上升趋势，但在喂食AC-AE三周后其TNF-α活性皆有降低，且在血清和脑组织中皆以4X组效果最佳(表一)。而已有文献指出在中风后加入resveratrol六小时和二十四小时进行治疗，其IL-1β和TNF-α表现显著降低(Shinetal.,)。由结果可推测AC-AE可降低促发炎因子TNF-α活性进而改善缺血性中风后所造成的发炎情形。
表一、椴木牛樟芝子实体酒精萃取物对中风大鼠腻内及血清之肿瘤坏死因子激素含量之影响。
3.牛樟芝酒精萃取物对内生性抗氧化酵素之影响
内源性抗氧化剂超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性在预防氧化损伤中占有重要角色(Akyoletal.,)；因此将测定脑中抗氧化酵素活性来观察AC-AE是否可促进内生性抗氧化酵素系统；结果显示在血清部分其vehicle组不论是在SOD、GPx或CAT表现皆低于其他组别，但在喂食AC-AE三周后抗氧化酵素表现皆有上升趋势，并且在GPx组以2X组表现上升最多，而在SOD以及CAT喂食组别则有呈现剂量依赖性(表二)；而在脑组织部分，同样的其vehicle组不论是在SOD、GPx或CAT表现皆低于其他组别，但在喂食AC-AE三周后抗氧化酵素表现皆有上升趋势，并且各组皆以2X组表现上升最多(表三)。由结果可推测AC-AE可藉由促进内生性抗氧化酵素系统来改善缺血性中风后所造成的抗氧化系统失衡情形。
表二、椴木牛樟芝子实体酒精萃取物对中风大鼠血清内生性抗氧化酵素活性之影响。
表三、椴木牛樟芝子实体酒精萃取物对中风大鼠血清内生性抗氧化酵素活性之影响。
4.牛樟芝酒精萃取物对缺血性中风大鼠脂质过氧化作用之影响
从上述细胞实验结果以AC-AE进行预防下可降低氧化压力及缺氧环境下之自由基攻击损伤，而为了更进一步得知在动物实验是否有相同结果，因此本实验将测定中风后之大鼠血清以及脑部组织之脂质过氧化程度，结果显示在血清部分vehicle组与sham组相比其MDA含量有显著上升，但在喂食AC-AE三周后其MDA含量皆有显著降低，并以1X组效果最佳；而在腻组织部分vehicle组与各组相比皆有显著上升趋势，而在喂食AC-AE三周后，随着剂量的提升呈现剂量依赖性下降趋势，并以4X组下降最为显著。将中风大鼠先以30mg/kgresveratrol作为预防后，其resveratrol组相较于vehicle组之腻部皮质以及海马脑回体区之MDA有显著下降趋势(Simaoetal.,)；而AC-AE在此可有效降低MDA含量并且在血清1X与脑组织4X组抑制效果优于resveratrol组，因此证实AC-AE可显著改善中风后所造成之脂质过氧化情形(图十五)。而有文献指出以resveratrol作为治疗下其中风大鼠梗塞部位腻部皮质以及纹状区的ROS表现显著低于正常部位0.65及0.72倍，并可减少ROS诱导下之伤害，以提升缺血再灌注下的海马神经元细胞存活率(Shinetal.,；Clemensetal.,;Cuzzocreaetal.,2;Fusonetal.,;Soehleetal.,)。
图十五、椴木牛樟芝子实体酒精萃取物对缺血性中风大鼠之血清及腻部脂质过氧化作用影响。
5.牛樟芝酒精萃取物对发炎因子(iNOS、COX-2)基因表现之影响
已有文献指出缺血性中风后其发炎因子iNOS及COX-2会显著增加，而iNOS的生成会使NO表现量上升并与过氧化物结合产生氧化型亚硝酸盐进而造成中风后的脑组织及细胞损伤更加严重，但如能抑制iNOS以及COX-2的表现即可减缓中风后所造成的损伤(delZoppoetal.,2)。因此本研究以RT-PCR测定以AC-AE做为预防下是否能降低缺血性中风后所造成的发炎基因表现。其结果显示vehicle组的iNOS以及COX-2与其他组别相比皆有较高表现，而在喂食AC-AE三周后之iNOS表现皆有显著下降，并且以4X剂量最为显著，而在COX-2部分则以喂食组别2X及4X表现量最低(图十六)。文献指出resveratrol可降低缺血性再灌注诱导之NF-κB之表现，并激活JNK路径进而降低COX-2和iNOS之产生(Simaoetal.,)；因此喂食AC-AE三周后可抑制中风后其发炎因子之iNOS以及COX-2表现。
图十六、椴木牛樟芝子实体酒精萃取物对中风大鼠腻内发炎激素mRNA表现量之影响。
6.牛樟芝酒精萃取物对内生性抗氧化反应基因(Nrf2、HO-1)表现之影响
由上述结果已证实先以AC-AE做为预防下可降低中风后所造成之氧化伤害及发炎反应等因子基因表现。而有文献证实氧化压力下所产生之活性物质会造成原本紧密结合的Keap1以及Nrf2分离，并活化Nrf2转位至细胞核内促进ARE抗氧化反应序列结合，并调整血红素激酶HO-1表现，而HO-1为诱导型，当在缺氧和兴奋的情况之下，血红素蛋白运转会加速而导致血红素氧化，而氧化型血红素并不能回收，因此需要HO-1来降低氧化型血红素(EmamaulleeandShapiro,;Yangetal.,;KimandVaziri,;Doreetal.,)。因此本研究以RT-PCR测定大鼠以AC-AE做为预防下是否能提升缺血性中风后之Nrf2及HO-1基因表现。其结果显示vehicle组其Nrf2以及HO-1与其他组别相比皆有较低表现，而在喂食AC-AE三周后之Nrf2表现皆有显著上升，并且在4X剂量下Nrf2表现最为显著，而在HO-1部分则以喂食组别1X及4X表现量最高(图十七)。文献指出，缺血再灌注2、6及24小时后其resveratrol预处理组别其Nrf2及HO-1mRNA表现皆显著高于中风组(Renetal.,)；而在此结果证实喂食AC-AE组别Nrf2以及HO-1表现高于resveratrol，因此表明，Nrf2/ARE讯号路径在脑缺血之神经保护作用中扮演着重要角色。
图十七、椴木牛樟芝子实体酒精萃取物对中风大鼠腻内抗氧化防御基因mRNA表现量之影响。
7.牛樟芝酒精萃取物对缺氧诱导因子(HIF-1α)蛋白表现之影响
在正常有氧情况下，细胞内PHD会利用氧气将HIF-1α降解，使得浓度下降，而在缺氧情形下，氧气浓度不足因此会抑制PHD对HIF-1α的降解，而此时HIF-1α蛋白会进入核中执行其转录因子的功能，活化大量的基因，并制造许多增加氧气张力的基因产物，如血红素氧化酶HO并增加下游HO-1的表现，促使血管新生因子增加使血管生成进而使血流量上升，并可抑制细胞色素c的释放，减少casepase被活化情形，进而达到减少细胞凋亡以及组织坏死等情形(LaMannaetal.,)。其结果显示vehicle组与其他组别相比HIF-1α蛋白质表现量较低，而在喂食AC-AE做为预防三周后可提升HIF-1α蛋白质表现，并以1X组提升HIF-1α蛋白质表现最多(图十八)，因此喂食AC-AE做为预防三周后可藉由诱发HIF-1α改善中风后所造成的缺氧损伤。而HIF-1α表现不会因为剂量的提升而有所生高，在此推测可能是因为体内本身就会因为缺氧而使HIF-1α表现提升，而在此时加入AC-AE低剂量会使表现加成，但HIF-1α可能不全然是中风后大鼠之神经保护机制，因此不会随着剂量提升而有所改变。
图十八、椴木牛樟芝子实体酒精萃取物对中风大鼠腻内缺氧诱导因子之蛋白质表现量。
结论
本研究探讨以椴木牛樟芝子实体酒精萃取物做为预防后之神经保护机制，并且是否具有改善缺血性中风之潜力。在细胞实验部分，牛樟芝子实体酒精萃取物可降低H2O2及CoCl2诱导氧化压力及低氧损伤环境下之细胞受损，表明可能是藉由降低活性物质ROS生成，使ROS无法诱导细胞脂质过氧化，进而免于细胞膜被破坏，降低细胞死亡；表明以椴木牛樟芝子实体酒精萃取物做为预防后对于缺血性腻中风是具有潜力的，因此之后再以动物实验，进一步查证以牛樟芝子实体酒精萃取物做为预防后是否可降低腻中风后发炎反应并提升内生性抗氧化防御机制；结果显示椴木牛樟芝子实体酒精萃取物于mg/kg时即具有降低发炎因子TNF-α、iNOS、COX-2之表现，但与resveratrol相比，iNOS及COX-2mRNA表现仍需提高剂量至mg/kg才可达到相同效果，因此本研究建议椴木牛樟芝子实体酒精萃取物剂量为mg/kg(人体剂量为7.89g)，并在本实验中发现椴木牛樟芝子实体酒精萃取物比起resveratrol更可提升脑中风后Nrf2表现，并提升下游抗氧化蛋白HO-1及抗氧化酵素GPx、catalase、SOD之表现，进而降低脂质过氧化情形；另一方面也发现牛樟芝子实体酒精萃取物可升缺氧诱导因子HIF-1α，调整下游调控基因，修复中风所造成之细胞损伤，进而降低腻部梗塞体积。由上述结果得知椴木牛樟芝子实体酒精萃取物做为预下可抵抗发炎反应及提升内生性抗氧化防御机制，因此具有潜力降低缺血性脑中风之神经缺损情形。但如果能更进一步定量并纯化出牛樟芝子实体酒精萃取物中内含之有效纯物质进行动物实验管喂，其大鼠所需食用量可能会下降许多，但其纯物质之作用机制需再进一步讨论。
